4-7. 粘着末端を利用したDNAの連結

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1) DNAの付着と連結

制限酵素で切断されて粘着末端をもったDNA断片は、同じ粘着末端をもつDNAと末端部分でアニールするので、簡単に付着する

酵素切断後のDNA末端は5'-Pと3'-OHなので、この状態でDNAリガーゼ(DNA連結酵素)を作用させると、2つのDNAの間でリン酸ジエステル結合が形成され、両者は1つの分子となる

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この反応はDNAの種類によらず起こり、試験管内反応で効率よく進むが、このことが遺伝子工学の技術が拡がった最大の理由の1つ

DNAリガーゼはDNA断片連結以外にも、DNAの環状化、短い標識二本鎖DNAの連結を介するDNAの標識などで使用される

2) DNAリガーゼ反応の実際

DNAリガーゼを反応させる場合は、5'-P, 3'-OHであることが必須であり、また反応にはATPなどの補因子が必要

補因子は酵素と複合体になってDNA末端に結合する

実験では活性が高くて使いやすい、T4ファージ由来のT4ポリヌクレオチドリガーゼ(T4DNAリガーゼ)が使用される

効率は低いがDNA-RNA、RNA-RNAの連結も行う

ニックを連結するこの反応をライゲーションという

連結したくないDNA-RNAは前もってホスファターゼで脱リン酸化しておくとよい

逆に5'末端が-OHとなっている場合は、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸基を5'末端に付加させておく必要がある

3) 同一粘着末端をもたないDNA末端の連結方法

平滑末端同士の連結

粘着末端の連結に比べて連結効率は低いが、反応させることはできる

DNA末端の安定化のため、ポリエチレングリコールなどを加えることがある

DNA末端形状の異なるDNAの連結

そのままでは連結させることはできず、以下の方策のいずれかを選択する

1. 末端を平滑末端にしてから強引にライゲーションする

2. 平滑末端にした後でリンカーライゲーションを行い、制限酵素処理の後で粘着末端ライゲーションを行う

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リンカー(制限酵素認識部位＋わずかに余分な配列をもつ短い二本鎖オリゴヌクレオチド)は通常非常に行動に加えて反応させるため、反応はよくすすむ

合成DNAとして購入できる

使用前に5'-Pとする必要がある

3. 平滑末端にした跡、ホモポリマー合成法によって別々の末端に粘着末端をつくり、その後ライゲーションを行う

4. DNA内部を別の制限酵素で切断してから連結反応を行う

各メーカーでライゲーション様のキットが販売されている

基本的にはT4ポリヌクレオチドリガーゼが入っているが反応を進みやすくさせるメーカー独自の反応安定化・促進剤も入っている

通常4℃一晩の反応が10分程度で終わる